丁酰膽*酯酶抑制劑活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào): BC5980

規(guī)格: 50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支試劑一，加入1.8mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝后可保存4周，避免反復(fù)凍融（該試劑為凍干試劑，可能存在不同瓶間肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實(shí)際質(zhì)量相同）。

2. 試劑四：臨用前加入17mL試劑二，充分溶解，用不完的試劑-20℃可分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑五：10mmol/L利凡斯的明溶液。臨用前取15μL 10mmol/L利凡斯的明溶液，加入985μL蒸餾水，配制成0.15mmol/L利凡斯的明溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配（此試劑用于陽(yáng)性管實(shí)驗(yàn)，選做）。

產(chǎn)品說(shuō)明：

丁酰膽*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又稱(chēng)血漿膽*酯酶，假性膽*酯酶，是一種絲*酸水解酶，由肝臟合成后進(jìn)入血液，幾乎存在于所有動(dòng)物組織中。與乙酰膽*酯酶（AchE）相比，BchE能夠有效水解較大的膽*酯，如丁酰膽*和苯甲酰膽*，而且可以清除有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥等神經(jīng)毒劑的毒害作用。有研究表明，BchE可作為阿爾茨海默病治療的重要靶點(diǎn)，BchE抑制劑被用于改善阿爾茨海默病患者記憶力減退、認(rèn)知功能障礙等病征。

BchE催化丁酰膽*水解生成膽*，膽*與二硫代硝基 苯甲酸（DTNB）作用生成5-巰基-硝基 苯甲酸（TNB），BchE抑制劑通過(guò)抑制BchE活性，減少丁酰膽*的水解。TNB在412nm處有吸收峰，可通過(guò)測(cè)定412nm處吸光度的變化，計(jì)算BchE抑制劑活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、天平、烘箱、粉碎儀/研缽/勻漿器、30-50目篩、超聲清洗儀、離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體的操作步驟請(qǐng)見(jiàn)“產(chǎn)品資料"文件

注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，請(qǐng)嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和操作時(shí)間。

2. 樣本吸光度A’_測(cè)定大于1.5或ΔA_測(cè)定接近ΔA_空白時(shí)，建議在樣本處理步驟增加組織樣本比例或?qū)⒎蹌颖九渲瞥筛邼舛鹊娜芤涸龠M(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA_測(cè)定小于0.01時(shí)，可以將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

3. 若用于比較不同試劑、提取物、藥物或組織對(duì)BchE的抑制程度，必須將試劑、提取物、藥物或組織勻漿配制成相同濃度進(jìn)行比較。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1005g柚果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進(jìn)行超聲提取，離心后取上清，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.372-0.205）-（0.166-0.112）=1.113，ΔA_測(cè)定=（A’_測(cè)定-A_測(cè)定）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.117-0.485）-（0.166-0.112）=0.578，計(jì)算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（1.113-0.578）÷1.113×100%=48.068%。

2. 取0.1014g柿果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進(jìn)行超聲提取，離心后取上清，稀釋16倍后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.372-0.205）-（0.166-0.112）=1.113，ΔA_測(cè)定=（A’_測(cè)定-A_測(cè)定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.706-0.149）-（0.166-0.112）=0.503，計(jì)算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（1.113-0.503）÷1.113×100%=54.807%。

3. 取50μL 0.15mmol/L利凡斯的明溶液，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.372-0.205）-（0.166-0.112）=1.113，ΔA_測(cè)定=（A’_測(cè)定-A_測(cè)定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.838-0.171）-（0.166-0.112）=0.613，計(jì)算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（1.113-0.613）÷1.113×100%=44.924%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Noor Atatreh, Sara Al Rawashdah, Shaikha S Al Neyadi. et al. Discovery of new butyrylcholinesterase inhibitors via structure-based virtual screening [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1): 1373-1379.

[3] Li Q, Chen Y, Xing S. et al. Highly Potent and Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors for Cognitive Improvement and Neuroprotection [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(10): 6856-6876.

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