細(xì)胞鐵含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5315

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1. 標(biāo)準(zhǔn)液：1 μmol/mL Fe³⁺標(biāo)準(zhǔn)液，臨用前取100μL 1μmol/mL Fe³⁺標(biāo)準(zhǔn)液，加入100μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實(shí)驗(yàn)中每管需要20μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積。）

產(chǎn)品說(shuō)明：

鐵元素是人體必須的微量元素之一，它是血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素及其他酶系統(tǒng)的主要成分，幫助氧的運(yùn)輸，促進(jìn)脂肪氧化。缺乏鐵元素容易造成貧血、代謝紛亂，并影響機(jī)體的免疫功能。

鹽酸羥胺將樣本中的Fe³⁺還原成Fe²⁺，Fe²⁺在弱酸條件下與鄰菲羅啉形成橙紅色配合物，在510nm處有吸收峰，測(cè)定該波長(zhǎng)吸光度即可計(jì)算鐵含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、超聲破碎儀、微量玻璃比色皿/96孔板、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入0.5mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，重復(fù)30次），于4℃，8000g離心10min，取上清待測(cè)。

若樣本為真菌、細(xì)菌等有細(xì)胞壁的微生物可以適當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間。

二、測(cè)定步驟

1. 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至510nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2. 在1.5mLEP管/96孔板按下表步驟加樣：

三、細(xì)胞鐵含量計(jì)算

1. 按細(xì)胞數(shù)目計(jì)算：

細(xì)胞鐵含量（ng/10⁴ cell） =（C標(biāo)準(zhǔn)液×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V提取×10³×55.845÷500

=27.922×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

2. 按蛋白濃度計(jì)算：

細(xì)胞鐵含量（ng/mg prot） =（C標(biāo)準(zhǔn)液×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×V提取×10³×55.845÷（Cpr×V提取）

= 27922.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL Fe³⁺標(biāo)準(zhǔn)液；V提?。杭尤胩崛∫后w積，0.5mL；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol=10³nmol；55.845：Fe的相對(duì)原子質(zhì)量，55.845ng/nmol；500：細(xì)胞數(shù)目，500萬(wàn)；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

1、 如果ΔA測(cè)定＜0.01，可適當(dāng)加大樣本量后重新測(cè)定；如果測(cè)定管吸光值大于0.8，建議將樣本用蒸餾水適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

2、 如果按蛋白濃度計(jì)算細(xì)胞鐵含量，需自行測(cè)定樣本上清蛋白濃度。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取500萬(wàn)細(xì)胞加入0.5mL提取液進(jìn)行超聲破碎提取，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.100-0.048=0.052，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.408-0.048=0.360，按細(xì)胞數(shù)目計(jì)算含量得：

細(xì)胞鐵含量（ng/10⁴ cell）=27.922×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) =4.033 ng/10⁴ cell

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