谷*甘肽還原酶活性系數(shù)（GRAC）檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC6000

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入1.2mL蒸餾水，充分溶解，2-8℃可保存4周；

2. 試劑三：臨用前取試劑三A加入0.537mL試劑三B，充分溶解，-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融；

3. 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四= 80μL：20μL：8μL：20μL（128μL，1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑五：臨用前加入1.2mL蒸餾水，充分溶解，-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融；

5. 試劑五工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑五：蒸餾水=5μL：95μL（0.1mL，5T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

谷*甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）是廣泛存在于真核與原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，該酶以核黃素衍生物核黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）為輔基，催化NADPH還原氧化型谷*甘肽（G SSG）生成還原型谷*甘肽（GSH），維持巰基和膜蛋白處于還原狀態(tài)。當生物體內(nèi)缺乏核黃素時，FAD含量相應減少，GR活性也隨之降低，谷*甘肽還原酶活性系數(shù)（GR Activation Coefficient，GRAC）迅速升高，出現(xiàn)唇炎、口角炎、結膜炎等臨床癥狀。因此，GRAC用于核黃素營養(yǎng)狀況評價，對于早期發(fā)現(xiàn)缺乏病患者采取防治措施具有重要意義。

GR催化NADPH還原G SSG，生成GSH，GSH與5，5’-二硫代-雙-（2-*甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反應產(chǎn)生2-硝基-5-*甲酸，2-硝基-5-*甲酸在波長412nm處有特征吸收峰，通過412nm處吸光度的變化可計算GR的活性。根據(jù)加入FAD前后GR活性的變化可計算得到GRAC。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）=1：5~10比例加入試劑一（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL試劑一），冰浴勻漿后，于4℃，12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細胞樣本：按細胞數(shù)量（10⁴）：試劑一體積（mL）=500~1000：1的比例加入試劑一（建議500萬細胞加入1.0mL試劑一），冰浴超聲破碎細胞（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 全血/紅細胞：建議取10μL全血/紅細胞，加入990μL試劑一，充分溶血混勻，于4℃，4000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

4. 血清/血漿等液體樣本：直接測定。若有渾濁請離心后取上清置于冰上待測。

二、 測定步驟

1．可見分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2．將工作液37℃預熱10min。

3．操作表：（在1.5mL EP管中加入下列試劑）

三、GRAC活性計算

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）

注意事項：

1. 建議準備核黃素水平正常的樣本進行檢測，方便與核黃素缺乏的樣本進行比較；如果沒有核黃素水平正常的樣本，可參考一般核黃素水平正常的樣本GRAC為0.9-1.2；

2. 如果樣本測定管吸光值大于1.5，建議將樣本用試劑一稀釋后進行測定；如果樣本測定管吸光值接近空白管，可適當增大樣本質(zhì)量重新提取或提高加樣表中樣本體積，對照管、空白管蒸餾水需進行相應調(diào)整。

3. 樣本蛋白濃度需自行測定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約0.11mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。

實驗實例：

1. 取0.1051g大鼠腎臟樣本，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得：A測定=0.482，A對照=0.465，A空白=0.084，計算得：

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）= 1.045。

2. 取10μL人紅細胞，加入990μL試劑一，充分溶血混勻，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得：A測定=0.530，A對照=0.529，A空白=0.084，計算得：

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）= 1.002。

3. 取馬血清樣本，直接按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得：A測定=0.453，A對照=0.451，A空白=0.084，計算得：

GRAC=（A測定-A空白）÷（A對照-A空白）= 1.005。

參考文獻：

[1] Sauberlich H E, Judd J H, Nichoalds G E, et al. Application of the erythrocyte glutathione reductase assay in evaluating riboflavin nutritional status in a high school student population [J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 1972, 25(8): 756-762.

[2] Gu CF, Chen YZ, Wang ZY. A study of the activation coefficients of blood glutathione reductase in the evaluation of experimental riboflavin deficiency [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 1981, 3(4): 251-260.

[3] Ono S, Hirano H. FAD-induced in vitro activation of glutathione reductase in the lens of B2 deficient rats [J]. Current eye research, 1984, 3(4): 663-665.

[4] He J, Hu ML, H YM, et al. Study on the optimum conditions for determination of glutathione reductase activity coefficient in whole blood [J]. Chinese Journal of Public Health, 2002, 18(5): 615-616.

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