小鼠白細胞介素1受體拮抗蛋白ELISA試劑盒

注意事項：※※※

1. 試劑盒應在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。 2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。 3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。 4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。 5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。. 6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請 用移液器小心吹打幾次。 7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試 劑代替本試劑盒中的某單個組分。 8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：

試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操 作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本 及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規(guī)定執(zhí)行。

小鼠白細胞介素1受體拮抗蛋白ELISA試劑盒

組成及儲存

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清： 將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀， 請再次離心，避免反復凍融。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作 為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：

血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標 物檢測濃度高于標準品的頂值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實 驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準備：

1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn) 結晶，請放入 37℃溫浴直到結晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍 濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待 其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度：2000、1000、500、250、 125、62.5、31.25、 0 pg/ml進行稀釋。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應 廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃 縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應孔中。

5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶 結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法：

? 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/ 孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。

? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行 雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中IL-1RΑ含 量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。 4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)

2. 靈敏度： 低可檢測小鼠 IL-1Rα 濃度達 15pg/ml， 20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性： 不與小鼠 IFN-γ、 IL-1α 、IL-1β 、IL-1 RII、 IL-1 R4、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6 、 IL-7、 IL-9 、IL-10、 IL-10 R、 IL-11、 IL-12 p70、 IL-13 、IL-17、 IL-18 反應，人 IL-1α 、 IL-1β 、IL-1 RII、 IL-1 R3、 IL-1 R4 、IL-1 R6、 IL-1 R9 等反應

4. 重復性： 板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%

5. 回收率： 在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 IL-1Rα，計算回收 率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 IL-1Rα，在標準曲線動 力學范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。