1、膽固醇對(duì)蛋白冠形成的影響

2、膽固醇調(diào)節(jié)蛋白冠的蛋白質(zhì)組指紋圖譜

為了獲得有關(guān)在胎牛血清中的SNP上形成的Nor-PC和Cho-PC的蛋白質(zhì)指紋圖譜的信息，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b）。結(jié)果表明，血清中的高水平膽固醇可以豐富載脂蛋白并減少NP上PC中的補(bǔ)體蛋白。

PC的形成遵循“Vroman效應(yīng)"，即早期吸附的高豐度蛋白質(zhì)將被具有更高親和力的蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性取代。接下來通過微尺度熱泳(MST)測(cè)量了這兩種蛋白與有或沒有膽固醇的SNP的結(jié)合親和力（圖2e）。表明，膽固醇可以通過差異調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白的親和力來重塑PC中的蛋白質(zhì)豐度。然后，進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，以探索在存在和不存在膽固醇的情況下APOE和SNP之間的相互作用。結(jié)果表明，膽固醇-蛋白質(zhì)和膽固醇-NP相互作用有助于重塑Cho-PC組成的結(jié)論。

3、膽固醇-蛋白冠增加巨噬細(xì)胞對(duì)納米顆粒的免疫反應(yīng)

由于PC已被廣泛認(rèn)為是NP的生物學(xué)特性，于是探討了Cho-PC對(duì)NP體外和體內(nèi)行為的影響。由于游離膽固醇和膽固醇預(yù)處理的NP都不能增加免疫反應(yīng)（圖3e，f），因此對(duì)NP的免疫反應(yīng)增加主要受到PC中膽固醇介導(dǎo)的變化的影響。然后，進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，以鑒定與SNPs-Cho-PC和SNPs-Nor-PC孵育后巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。與對(duì)照組相比，SNPs-Nor-PC治療組中鑒定出788個(gè)下調(diào)蛋白和785個(gè)上調(diào)蛋白（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7c）。盡管Nor-PC和Cho-PC都激活了巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，但Cho-PC引發(fā)了更強(qiáng)的反應(yīng)。通過炎癥相關(guān)通路的基因集變異分析(GSVA)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)了一致的變化（圖3i）。這些結(jié)果表明，Cho-PC可能比Nor-PC更大程度地增加免疫系統(tǒng)響應(yīng)NP的激活風(fēng)險(xiǎn)。

4、Cho-PC增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)NP的細(xì)胞攝取

由于細(xì)胞攝取對(duì)于納米藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和靶向效率至關(guān)重要，并且藥物通常由肝細(xì)胞代謝，進(jìn)一步研究Cho-PC是否可能影響肝細(xì)胞中NP的細(xì)胞內(nèi)化。使用HepG2細(xì)胞作為人肝細(xì)胞的體外模型，首先評(píng)估了AuNP（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8a）和SNP（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8b）的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞內(nèi)有更多的AuNPs-Cho-PC積累（圖4f，g）。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析發(fā)現(xiàn)，Cho-PC組中檢測(cè)到的Au多于Nor-PC組（圖4h）。由于向培養(yǎng)基中添加膽固醇會(huì)抑制NP內(nèi)化（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8d-g），因此細(xì)胞對(duì)NP的攝取增強(qiáng)可能應(yīng)歸因于膽固醇誘導(dǎo)的Cho-PC的特定蛋白質(zhì)成分，而不是膽固醇本身。

為了進(jìn)一步研究Cho-PC誘導(dǎo)的NPs增強(qiáng)細(xì)胞攝取所需的關(guān)鍵因素，檢測(cè)在不同類型的內(nèi)吞作用抑制劑存在下NPs的內(nèi)化（圖4i-k和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8h-m）。結(jié)果表明，膽固醇和肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)的機(jī)制有助于增強(qiáng)對(duì)高膽固醇血清中形成的冠-納米顆粒復(fù)合物的攝取。由于攝取所需的細(xì)胞表面受體在PC介導(dǎo)的細(xì)胞攝取NPs中的既定作用，測(cè)試了低密度脂蛋白受體(LDLR)和B型清道夫受體1型(SR-B1)是否參與。在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中，細(xì)胞預(yù)先與LDL和HDL預(yù)孵育以阻斷LDLR和SR-B1，并使用牛血清白蛋白(BSA)孵育作為對(duì)照。盡管預(yù)孵育在一定程度上抑制了SNPs-Nor-PC和SNPs-Cho-PC的攝取，但只有LDL和HDL對(duì)SNPs-Cho-PC的攝取具有比對(duì)SNPs-Nor-PC更明顯的抑制作用（圖4l）。因此，LDLR和SR-B1可能參與脂蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化增強(qiáng)。

5、高膽固醇血癥小鼠體內(nèi)納米顆粒的生物分布

Cho-PC是否可以改變NP的體內(nèi)生物分布，通過高膽固醇飲食喂養(yǎng)小鼠15周建立高膽固醇血癥小鼠模型（圖5a）。詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，與FBS和人血清中的結(jié)果相比，PC的蛋白質(zhì)組成發(fā)生了類似的變化（圖5c、d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9）。因此，血清膽固醇差異水平對(duì)PC制劑的調(diào)節(jié)也可以在小鼠高膽固醇血癥模型中重現(xiàn)，與人血清結(jié)果一致。接下來，比較了從正常小鼠和高膽固醇血癥小鼠收集的血液和組織中AuNP的體內(nèi)生物分布（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10a、b）。1小時(shí)后，在高膽固醇血癥小鼠中觀察到肝臟中鋅和銅水平增加。當(dāng)24小時(shí)時(shí)，肝臟中的差異消失，但睪丸、腸、腎和脾中出現(xiàn)差異，這表明某些金屬元素的分布可能受到健康狀態(tài)依賴性靜脈注射納米藥物方式的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)對(duì)健康和高膽固醇血癥個(gè)體進(jìn)行靜脈注射時(shí)，基于納米粒子的納米藥物可能會(huì)出現(xiàn)不同的體內(nèi)命運(yùn)，例如生物相容性和生物分布，這為精密納米醫(yī)學(xué)提供了重要的見解（圖6）。用熒光標(biāo)記的衍生物測(cè)量了SNP的體內(nèi)分布，結(jié)果表明，高膽固醇血癥會(huì)影響納米粒子的體內(nèi)生物分布。